目前CAR-T细胞多基于自体T细胞进行制备，T细胞的数量及质量是影响CAR-T制备及后续效果的一个关键因素。大多数血液肿瘤的治疗药物会造成骨髓抑制、T细胞耗竭和T细胞功能缺陷，因此CAR-T细胞采集前有非常严格的筛选及洗脱建议，尽管如此，仍有不少患者面临采集困难、CAR-T制备失败或因T细胞导致的CAR-T疗效不佳等风险，主要原因有：

（1）采集前因肿瘤进展或前序治疗所致的ALC数值低需增加单采循环数、肿块压迫血管/神经无法建立深静脉通道等均会增加单采难度，并有失败的风险；

（2）前序治疗药物可能影响T细胞质量，如接受多轮化疗的DLBCL患者的CD27- CD28- 衰老T细胞增加，因此在培养过程中用CD3和CD28激活时，T细胞扩增和活力降低，为获得足量的CAR-T细胞延迟培养天数同样会增加CAR-T细胞的衰老和凋亡[2]。

（3）自体造血干细胞移植（ASCT）会显著改变T细胞亚群的组成[3]，并引发代谢重编程，这些变化可能削弱T细胞在免疫治疗中的功能适应性[4]。这一现象在嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗中尤为重要。

因此在前序治疗或早期患者中及早冻存PBMC是良好的方案，能让自己将来多一份应对疾病的机会。

那么冻存与非冻存的PBMC制备出来的CAR-T的效果是否一致，是应当首要考虑的问题。

2022年Julieta Abraham-Miranda等人发表的研究由Moffitt癌症中心与Kite Pharma合作完成，系统比较了新鲜与冷冻PBMC作为起始材料在生产第二代抗CD19 CAR-T细胞（分别携带CD28或4-1BB共刺激结构域）过程中的差异。研究发现冷冻保存的PBMC制造过程中CAR-T细胞扩增较慢，但不会影响表型。且通过新鲜或冷冻保存PBMC制造CAR-T细胞时，CAR-T细胞激活，细胞因子产生和体外抗肿瘤细胞毒性并没有差异。这项研究提示我们PBMC的提早冷冻保存可能是解决CAR-T制备过程中T细胞来源问题的解决方案，而不会损害最终CAR-T产品的质量[5]。

研究从30名健康供者中同时获取新鲜和冷冻的PBMC，使用相同的病毒批次并行制备CAR-T细胞（h1928z与h19BBz），研究首先通过流式细胞术评估了冷冻保存对导入效率和CAR密度的影响。结果显示新鲜或冷冻保存的PBMCs之间没有观察到导入效率和CAR密度的显著差异。

但冷冻保存的PBMC显著增加了扩增期间CAR-T细胞的倍增时间。与h1928 zfresh CAR-T细胞相比，h1928 zcryo中的倍增时间高1.25倍，而h19 BBzcryo中的倍增时间比h19 BBzfresh CAR-T细胞高1.5倍。

以往研究证明，CAR-T细胞的扩增、持久性和抗肿瘤活性取决于细胞表型，分化程度较低的表型CAR-T细胞疗法中的功能越强，该研究中CD4/CD8比例，T细胞记忆亚群（如中央记忆型、效应记忆型）分布，新鲜组与冷冻组之间无显著差异。这说明冷冻并未改变T细胞的基本特征。

线粒体稳态在CAR-T细胞存活和功能中起关键作用。线粒体生物发生和线粒体自噬的诱导对于维持线粒体健康以满足活化的CAR-T细胞的ATP需求至关重要。研究分析了线粒体膜电位、生物量以及激活诱导的细胞凋亡水平，两组之间保持一致，表明冷冻并未损害T细胞的代谢健康或抗凋亡能力。

冷冻未影响CAR-T与靶细胞接触后的活化、磷酸化水平。

为了进一步比较新鲜和冷冻CAR-T细胞的效应功能，研究量化了用表达hCD 19的靶细胞体外刺激后细胞因子分泌。发现h1928z CAR-T细胞（CD28共刺激）在冷冻组中IFN-γ和TNF-α分泌显著降低，而h19BBz组则无此现象。但体外细胞溶解实验表明，新鲜和冷冻h1928 z和h19 BBz CAR-T细胞以相似的动力学和效率溶解靶细胞，说明两组CAR-T细胞的体外杀伤能力并无差异。

总结来说，冷冻PBMC可作为CAR-T制备的起始材料，虽略微延长扩增时间，但不影响最终产品的表型、激活状态、代谢健康及体外杀伤效能[5]。