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科普日谈丨外泌体分离纯化方法

发布时间:2022-09-20    浏览量:0

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  外泌体研究自过去二十年以来一直是焦点领域。人体内多种细胞在正常以及病理状态下均可分泌外泌体,如间充质干细胞、内皮细胞、肿瘤细胞、骨髓细胞、免疫细胞等。外泌体与干细胞有着类似的功能,在组织工程与再生医学方面的临床前期研究,尤其是干细胞外泌体。  

  外泌体的分离和纯化是外泌体相关基础研究和临床应用的瓶颈问题之一。各种研究表明,外泌体的临床应用存在一些挑战,因为在各种纯化过程中,没有将外泌体与其他微粒分离以及分离各种外泌体亚群的标准方法。下面将简单介绍下外泌体的不同分离纯化方法。

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  目前外泌体分离的最传统和最广泛使用的技术之一是差速离心,它根据密度和大小纯化外泌体。该方法最常见的操作是先低速去除细胞及碎片,再通过超速离心形成外泌体沉淀,进而实现外泌体的富集。该方法简单、有效且经济,但该过程的产量和特异性较低,还可能被其他类似大小的微粒污染。此过程中的高速离心可能会损坏外泌体。目前,差速离心已与蔗糖密度梯度或蔗糖垫相结合,以提高分离外泌体的产量和纯度。

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                                                                                                   图1:差速离心提取外泌体
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  切向流超滤是一种基于过滤器孔径分离外泌体的选择。首先用孔径大于外泌体粒径的滤膜或者离心法去除大颗粒,然后再用孔径较小的超滤膜截留外泌体,从而实现外泌体的富集。过滤方法比差速超速离心省时省力,分离速度快,操作简单。然而,由于这种方法是基于大小的,因此很难将外泌体与其他大小相同的颗粒(如凋亡小体或微泡)分离。

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                                                                                         图2 左:常规过滤  右:切向流过滤
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  尺寸排阻色谱法,类似于过滤,利用排阻层析柱里的多孔固定相,使较小的颗粒在柱子里的保留时间更长,从而实现按照粒径大小对样品进行分离。这种方法能够获得高纯度的外泌体,保证外泌体的完整性和生物活性。尽管外泌体纯化的产量很高,但该技术耗时,且需要专门的装置和填料,不便于从大样本量中获得外泌体。

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                                                                                         图3:尺寸排阻色谱法提取外泌体
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  免疫亲和捕获法通过在层析柱、磁珠和微流控系统中将外泌体相关抗原与抗体结合,能够获得高纯度的外泌体。这种方法能够捕获膜表面特定蛋白质的外泌体,可富集特定的一类外泌体,可用于分离外泌体的不同亚型。但是这种方法的成本高,产率低。

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                                                                                                  图4:免疫磁珠分离外泌体
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  聚合沉淀法也可用于外泌体的纯化,主要是利用聚乙二醇等聚合物,将外泌体沉淀,操作非常简便。但是这种方法不是特异性的,可能会共沉淀其他颗粒,化学处理也可能通过该过程破坏外泌体。此外,颗粒的再悬浮很复杂,不适合功能性使用。

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图5:PEG沉降制备外泌体

  总体而言,每种纯化方法都有其优点和缺点,外泌体分离纯化方案应该是根据样本形式(样本来源、样本体积、潜在的杂质类型)和下游的应用,并且综合考虑得率、纯度、成本和时间,灵活选择一种或多种方法提高纯度和数量。 

  齐鲁细胞基于标准化细胞培养条件,建立了完善的外泌体分离纯化及检测鉴定平台,处理通量高、分离时间短、杂质去除率高。透射电子显微镜、蛋白标志物检测以及纳米流式检测结果显示,外泌体产品产量和纯度均处于国际领先水平。

图6.:先进的外泌体制备与检测鉴定平台

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图7:MSC-Exo的检测鉴定结果


参考文献:

[1] Hassanzadeh A, Rahman HS, Markov A, Endjun JJ, Zekiy AO, Chartrand MS, Beheshtkhoo N, Kouhbanani MAJ, Marofi F, Nikoo M, Jarahian M. Mesenchymal stem/stromal cell-derived exosomes in regenerative medicine and cancer; overview of development, challenges, and opportunities. Stem Cell Res Ther. 2021 May 21;12(1):297.